Matsui

 

センター長、教授 薬博 松居 靖久
助教 理博 林 陽平
助教 理博 大塚 慧
助教 理博 太田 博充
助教 農博 丹藤 由希子
技術職員 合原 生恵
技術補佐員 小泉 藤美
技術補佐員 松岡 (伊藤) 由美
技術補佐員 竹原 雅子花



医用細胞資源センターでは、細胞バンク事業と、生殖細胞および多能性幹細胞の制御機構に関する研究を行っている。

細胞バンク

医用細胞資源センターでは、腹水癌細胞株および、ヒト癌細胞、白血病細胞をふくむ培養細胞株、薬剤耐性細胞株、ハイブリドーマなどを対象とした細胞バンク事業を行っており、本ホームページ上に本施設が保存する細胞株のカタログを公開し、希望者へ供給を行っている(http://www.idac.tohoku.ac.jp/dep/ccr/)。また、これまでに行われたナショナルバイオリソースプロジェクトにおいて、多くの細胞株について理化学研究所バイオリソースセンターと共有し、現在、それら細胞株の供給は主に理研が行っている。一方、新たな細胞株の収集と分譲の準備を進めている。さらに細胞株の品質管理としてマイコプラズマ除去、DNAフインガープリンティング、アイソザイム検査を行っている。

大学連携バイオバックアッププロジェクト(IBBP)

大災害に備えて研究途上にある生物試料をバックアップ保存する、全国的な取り組み(大学連携バイオバックアッププロジェクト (IBBP))が今年度から始まった。岡崎の基礎生物学研究所に保存施設を作り、全国の研究者のバックアップ保存用の生物試料を無料で保管する。医用細胞資源センターは、IBBPの東北地区大学サテライト拠点としてこのプロジェクトに参加している。

研究内容

生殖細胞は、全ての種類の細胞へ分化し個体全体を作り出す源になることのできる唯一の細胞で、この不思議な性質を分子レベルで解き明かすことをめざした研究を行っている。生殖細胞は、胚発生の初期段階で多能性幹細胞の一部から分化運命を決定され、始原生殖細胞として現れる。さらにその分化過程では、独特なエピジェネティックな変化などにより、個体発生全能性を獲得する。私たちの研究室では、始原生殖細胞の分化運命決定や、その運命を全うするための分子メカニズムについて、鍵となる遺伝子の同定とそれらの機能解析による解明を行っている。また生殖細胞は比較的容易に、もとの多能性幹細胞へ逆戻りできる性質を持っており、その分子機構の解明から、多能性幹細胞と生殖細胞がどのような関係にあるのかを明らかにすることを試みている。写真は、マウス胚発生の初期段階で、形成されてまもない始原生殖細胞(緑)を示している。

最近のトピックス

1) DNAメチル化による、がん精巣抗原遺伝子Fthl17 の発現制御機構
生殖細胞と、がん細胞で共通して発現が認められ、他の正常組織では発現が低い、がん精巣抗原(cancer/testis antigen; CTA)遺伝子の、生殖細胞と、がん細胞における発現制御機構の相違を明らかにする目的で、CTA遺伝子の1つ、Fthl17 (Ferritin, heavy chain like 17) に着目し、DNAメチル化を中心とした発現制御機構解析を行いました。まずFthl17は、正常組織と比較して肺がん細胞では中程度の発現を、また精巣内で精子を形成する元となる精原幹(Germline stem; GS)細胞では高いレベルで発現していることを確認しました。次にバイサルファイト・シークエンス法とメチル化レポーターアッセイにより、肺がん細胞、GS細胞では、ともに遺伝子上流領域のDNA低メチル化が発現誘導を引き起こしていることを明らかにしました。さらに、これらの細胞では、転写開始点直近の隣り合った異なる領域のDNAメチル化状態に違いがあり、それぞれの細胞での発現レベルを制御している可能性が示唆されました。

正常組織と比較して、がん細胞では、遺伝子上流領域の-0.6~-0.3 kbの部分の低メチル化状態が中程度の発現を、また精原幹細胞では-0.3~0 kbの部分の低メチル化状態が高レベルの発現を引き起こすことがわかりました。

2) 体細胞を生殖細胞に近づける試み
生殖細胞は受精を経て次世代個体を生み出すという個体発生全能性をもっていますが、体細胞にそのような性質はありません。このような性質の違いがどのように生みだされるのか、また、どのように制御されているのかを明らかにするため、わたしたちは、培養下で体細胞から生殖細胞を直接誘導し、そのメカニズムを解明することを考えました。
体細胞から生殖細胞を直接誘導する戦略として、体細胞では発現しておらず生殖細胞で発現している、多能性関連遺伝子と生殖細胞特異的遺伝子を同時に発現誘導することを考えました。具体的には、多能性関連遺伝子の発現誘導には、山中4因子発現プラスミド(Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc)の導入を行いました。また生殖細胞特異的遺伝子の発現誘導を行うために、生殖細胞では遺伝子の発現に対して促進的なエピゲノム状態が多く見られることに注目し、その状態に近づけるために、RNA干渉法によるDNAのメチル化酵素遺伝子の発現阻害と、低分子化合物によるH3K27 tri-methylation(H3K27me3)を含む複数の抑制的ヒストン修飾の阻害、および細胞分化を促進する働きのある因子であるTGF-βの阻害を組み合わせる処理を行いました。その結果、発現レベルは低いながらマウス胎仔線維芽細胞(MEF)において、生殖細胞特異的遺伝子群を発現誘導することに成功しました。また体細胞性遺伝子の発現は誘導されていなかったことから、生殖細胞特異的遺伝子の発現誘導は非特異的な転写活性化によるものではないと考えられます。一方、神経系特異的遺伝子など、いくつかの組織特異的遺伝子の発現誘導も、同時に見られることがわかりました。以上の結果は、MEFでは生殖細胞特異的遺伝子を含む組織特異的遺伝子の発現は、DNAメチル化やヒストンH3K27me3を含むヒストン修飾などによるエピジェネティック制御を介して抑制されていることを示唆しています。

Sekinaka,T., Hayashi, Y., Noce, T., Niwa, H., Matsui, Y. Selective de-repression of germ cell-specific genes in mouse embryonic fibroblasts in a permissive epigenetic environment. Scientific Reports 6:32932 (2016). DOI: 10.1038/srep32932

図1 培養下で体細胞の遺伝子発現パターンを生殖細胞に近づける手法

抑制的ヒストン修飾などを阻害する低分子化合物とともに、DNAメチル化酵素の発現を低下させることのできるRNA干渉法を使って、マウス胎仔線維芽細胞を数日間、培養することより、遺伝子発現パターンを生殖細胞に近づけることに成功しました。赤色で示されている細胞が生殖細胞へ近づいた細胞(生殖細胞マーカーであるDazl陽性細胞)です。また、青色は細胞の核(DAPIによる染色)を示しています。

3) Matsui, Y. et al. The majority of early primordial germ cells acquire pluripotency by Akt activation. Development 141, 4457-4467 (2014).
始原生殖細胞は多能性幹細胞から分化するが、通常その分化は精子または卵子に向かって一方向に進み、他の種類の細胞への分化や、分化を後戻りすることはない。しかし私たちのこれまでの研究から、いくつかの増殖因子とともに培養すると、一部の始原生殖細胞が1週間ほどで多能性幹細胞へ再プログラム化されることが明らかになっている。さらに細胞内情報伝達分子のAktを強く活性化すると、比較的早い発生段階である10.5日胚の始原生殖細胞では、その過半数が多能性幹細胞へ変化することを見出した。この結果から、始原生殖細胞と多能性幹細胞は密接に関連していて、情報伝達系の活性化のみで容易に多能性幹細胞へ変化するポテンシャルを持っていることがわかった。図はAktの活性化により始原生殖細胞から樹立された多能性幹細胞を示す。

4) Okamura, D. et al., Cell-cycle gene-specific control of transcription has a critical role in proliferation of primordial germ cells. Genes & Development 26, 2477-2482 (2012).
始原生殖細胞で特異的に発現する遺伝子のスクリーニングを行い、その結果得られたLarp7が始原生殖細胞の増殖に重要な役割を果たしていることを見いだした。Larp7は7SK snRNP複合体の構成因子であり、この複合体は転写伸長を促進するP-TEFbタンパク質と結合し、その活性を抑制することにより細胞内での転写活性を調節する働きがある。このLarp7遺伝子をノックアウトしたマウス胚では、始原生殖細胞がある程度増殖した後、正常胚と比べて早い段階で細胞周期がG1期で停止し、始原生殖細胞数が顕著に少ない状態になることから、正常な始原生殖細胞ではLarp7がG1期からS期への移行を促進する働きがあることがわかった。さらにLarp7を含む7SK snRNPの働きにより始原生殖細胞内の活性型P-TEFbの量が減少すると、G1期からS期への移行を阻害するCDK阻害因子(CDKI)遺伝子の発現が抑制され、これにより始原生殖細胞の細胞周期の進行が保証されることを明らかにした(下図参照)。

5) Mochizuki, K. et al., Implication of DNA demethylation and bivalent histone modification for selective gene regulation in mouse primordial germ cells. PLoS ONE 7, e46036 (2012).
始原生殖細胞特異的遺伝子は、それらの発現制御領域のDNAの脱メチル化に依存して発現上昇することを明らかにした。一方で、体細胞で発現する遺伝子など、始原生殖細胞で発現しない遺伝子はDNA脱メチル化状態にあるが、転写開始点付近で転写を抑制するヒストンH3リジン27のメチル化が起こっていることを示した。この研究により、DNA脱メチル化と抑制的なヒストンメチル化が巧妙に組み合わさることにより、始原生殖細胞での特異的遺伝子発現が保証されている可能性を初めて示唆した。このようなエピジェネティック制御は、多能性幹細胞において転写を一時的に抑制するメカニズムとして働いていると考えられている2価(bivalent)ヒストン修飾と同様、生殖細胞が受精後の胚発生過程で、細胞ごとにさまざまな遺伝子を迅速に発現することを可能にするために生殖細胞に備わったメカニズムである可能性が考えられる。図は始原生殖細胞(PGC)の分化にともない、PGC特異的遺伝子はDNAが脱メチル化され発現が上昇するのに対して、体細胞遺伝子(Soma)ではヒストンH3K27のメチル化により発現が抑制される様子を模式的に示す。

6) Maeda et al., Max is a repressor of germ-cell-related gene expression in mouse embryonic stem cells. Nature Communications 4, 1754 (2013). 多能性幹細胞は、通常は外胚葉性の細胞に変化したのち、そのごく一部が始原生殖細胞に分化するが、生殖細胞と多能性幹細胞は共通した遺伝子発現などの性質を共有し、直接的に生殖細胞へ変化する可能性が考えられる。今回、新たに未分化状態で維持されているES細胞で、転写制御因子Maxの発現を低下させると、生殖細胞特異的遺伝子の発現が全ゲノム的に上昇することをみいだした。またMaxはES細胞においてヒストンH3K9メチル化酵素のG9a, GLPと複合体を作り、さらに生殖細胞特異的遺伝子のプロモーター領域に結合することで、H3K9メチル化を介してそれら遺伝子の発現を抑制することが明らかになった。この結果から、多能性幹細胞ではH3K9のメチル化が、始原生殖細胞へ変化することを押しとどめているバリアとして働いていて、このバリアが解除されることが、多能性幹細胞が始原生殖細胞へ変化するためのスイッチの一つとして働いている可能性が考えられる。図は、Maxのノックダウンにより始原生殖細胞特異的遺伝子を発現するようになったES細胞を示す。緑が始原生殖細胞特異的なVasa-Venusレポーター遺伝子の発現を示す。また赤はH3K9のメチル化を示し、Vasa-Venus陽性細胞では低メチル化になっていることがわかる。青は細胞核を示す。